Po kryoprotektívnej perfúzii sa pacient nevkladá priamo do tekutého dusíka.
Pacient prechádza počítačom riadeným teplotným programom, ktorý trvá niekoľko dní. Senzory umiestnené v tele pacienta ukazujú, či sa jednotlivé anatomické oblasti chladia rovnomerne, alebo sa medzi nimi vytvárajú nebezpečné teplotné gradienty.
Počas poklesu teploty sa menia aj nároky na riadenie procesu. Skoré chladenie má zabrániť vzniku ľadu. V blízkosti teploty skleného prechodu a pod ňou sa dôležitejšou než rýchlosť stáva presnosť a rovnomernosť teploty.
Prečo je riadené chladenie potrebné
Kryoprotektívne látky umožňujú zabrániť vzniku ľadu aj pri nižšej rýchlosti chladenia. Umožňujú tkanivu s vysokým obsahom vody prejsť do vysoko viskózneho sklovitého stavu namiesto rozsiahlej kryštalizácie.
Teplota skleného prechodu, označovaná Tg, závisí od zloženia a koncentrácie roztoku aj od spôsobu merania. Nejde o jedinú univerzálnu biologickú hranicu, ale o rozsah teplôt.
Pri roztokoch používaných v kryopreservácii človeka sa toto rozpätie zvyčajne pohybuje okolo -120 °C až -135 °C.
Nad týmto rozsahom môže príliš pomalé chladenie umožniť vznik a rast ľadových kryštálov. Pod ním sa materiál čoraz viac správa ako krehká pevná látka.
Ak sa povrch chladí výrazne rýchlejšie než jadro, jednotlivé oblasti sa zmršťujú v rôznej miere. Vzniknuté termomechanické pnutie môže spôsobiť trhliny.
Z toho vyplýva úzka hranica medzi potrebami jednotlivých fáz: pred vitrifikáciou treba chladiť dostatočne rýchlo, po prechode tkaniva do sklovitého stavu zas starostlivo riadiť teplotné gradienty a rýchlosť chladenia.
Podrobnosti o tomto fázovom prechode nájdete v článku o rozdiele medzi zamrazením a vitrifikáciou.
Prvá generácia chladiaceho boxu
Prvá generácia systému Tomorrow.bio, chladiaci box V1, položila základy riadeného chladenia celého tela.
Pacient je umiestnený vo vyhradenej izolovanej komore. Počítač riadi kryogénne prostredie v komore, zatiaľ čo termočlánky merajú teplotu na viacerých miestach.
Riadiaca jednotka sa riadi naprogramovanou teplotnou krivkou a nechladí nepretržite maximálnym výkonom. Údaje z každého senzora sa zaznamenávajú ako súčasť teplotného záznamu pacienta.
Už tým sa tento postup zásadne odlišuje od priameho ponorenia. Zariadenie môže spomaliť, prerušiť alebo zmeniť podmienky v komore podľa toho, čo sa skutočne deje s pacientom.
Druhá generácia systému založená na dewarovej nádobe
Druhá generácia riešenia Tomorrow.bio využíva riadené chladenie priamo v špeciálne navrhnutej dewarovej nádobe.
Pacient zostáva v dewarovej nádobe, ktorej špeciálne veko obsahuje chladiace zariadenie, počítačové riadenie, ventily, prípojky senzorov a priechodky pre termočlánky.
Termočlánky sú umiestnené na viacerých miestach v tele pacienta. Ďalšie senzory sledujú tepelné prostredie vo vnútri dewarovej nádoby.
Systém tak nesleduje iba nastavenú cieľovú teplotu. Sleduje aj to, ako rýchlo sa mení teplota v jednotlivých meraných oblastiach pacientovho tela.
Počítač upravuje teplotný gradient v dewarovej nádobe a rýchlosť poklesu tak, aby namerané hodnoty zostali v rozsahu povolenom protokolom.
Veľké telo nemôže byť počas chladenia dokonale izotermické. Praktickým cieľom je minimalizovať rozdiely medzi oblasťami a zabrániť tomu, aby sa niektorá meraná oblasť ochladzovala nebezpečne rýchlejšie alebo pomalšie než ostatné.
Tvar dewarovej nádoby zároveň znižuje počet manipulácií medzi riadeným chladením a kryogénnym uskladnením. Tá istá uzavretá nádoba vytvára okolo pacienta stabilné a symetrické prostredie.
Nastavená teplota nie je teplota pacienta
Riadiaca jednotka môže prostredie ochladiť rýchlo. Nedokáže však okamžite dosiahnuť, aby stred ľudského tela dosiahol rovnakú teplotu.
Teplo musí z hlbších tkanív postupne odvádzať smerom k povrchu tela. Tvar tela, jeho zloženie, rozloženie kryoprotektívnej látky a umiestnenie senzorov ovplyvňujú veľkosť tohto zaostávania.
Preto nepostačuje jediný senzor v komore. Nominálna teplota prostredia -130 °C nedokazuje, že aj každá meraná časť pacientovho tela dosiahla -130 °C.
Riadiaci systém musí súčasne zohľadňovať absolútne teploty aj rozdiely medzi jednotlivými meracími kanálmi. Dôležité sú údaje z najpomalšie sa ochladzujúceho miesta, z najrýchlejšie sa ochladzujúceho miesta aj celkový rozptyl nameraných hodnôt.
Dôležitá je aj kalibrácia, umiestnenie a spojitosť termočlánkov. Nepravdepodobné hodnoty a výpadky senzorov treba zaznamenať a vyhodnotiť, nie ich bez upozornenia zahrnúť do priemeru výslednej krivky.
Trojfázový teplotný program Tomorrow.bio
Súčasný protokol má tri odlišné fázy. Uvedené hodnoty sú pracovné cieľové hodnoty pre toto zariadenie a daný kryoprotektívny postup, nie univerzálne konštanty platné pre každý vitrifikačný systém.
1. Rýchly pokles k teplote -130 °C
V prvej fáze teplota pacienta klesá od teploty suchého ľadu k približne -130 °C tak rýchlo, ako to bezpečne umožňuje rozptyl nameraných teplôt.
Rýchlosť je v tejto fáze dôležitá, pretože v nedostatočne chránených oblastiach môže stále vznikať ľad, skôr než tkanivo prejde do sklovitého stavu.
Počítač sa neriadi iba uplynutým časom. Sleduje termočlánky a podľa nich upravuje chladiace prostredie okolo pacienta.
2. Riadené prehriatie smerom k -120 °C
Po dosiahnutí približne -130 °C sa aktívne chladenie obmedzí a pacient sa môže prirodzene zohriať na približne -120 °C.
Ide o fázu žíhania. V blízkosti Tg si kryoprotektívny materiál zachováva dostatočnú molekulovú pohyblivosť, aby sa časť nahromadeného mechanického pnutia uvoľnila.
Toto zahriatie zároveň dáva teplejším a chladnejším oblastiam čas na vyrovnanie teploty pred ďalším prechodom materiálu do pevnejšieho sklovitého stavu.
Žíhanie neodstraňuje biologické poškodenie, ktoré už vzniklo. Jeho účel je užší: znížiť teplotné gradienty a pnutie vzniknuté nerovnomerným zmršťovaním.
3. Pokles na -196 °C rýchlosťou približne 1 °C za hodinu
Od približne -120 °C je cieľová rýchlosť chladenia približne 1 °C za hodinu, až kým pacient nedosiahne teplotu tekutého dusíka.
Tento posledný interval 76 stupňov trvá približne tri dni, ešte pred započítaním prestávok a zásahov riadiaceho systému.
Udržať rýchlosť chladenia 1 °C za hodinu vo veľkom tepelne nerovnomernom tele si vyžaduje aktívne riadenie, nie iba nastavenie časovača.
Riadiaca jednotka musí neustále upravovať prostredie v dewarovej nádobe tak, aby teploty merané vnútornými termočlánkami klesali čo najrovnomernejšie a bez nadmerných gradientov.
Ak sa jedna oblasť ochladzuje pomalšie, ďalšie ochladenie prostredia môže inú oblasť ochladiť príliš rýchlo. Presné riadenie vyžaduje vyhodnocovať údaje zo všetkých senzorov, nie riadiť sa jediným meraním.
Prečo je fáza žíhania vedecky odôvodnená
Výskum vitrifikácie väčších objemov poukazuje na dve protichodné riziká: nedostatočné chladenie nad Tg a nadmerné mechanické pnutie v okolí Tg a pod ňou.
Štúdia z roku 2024 o vitrifikácii objemu porovnateľného s ľudským orgánom použila viacero vnútorných snímačov a dospela k záveru, že žíhanie znižuje teplotné gradienty pred prechodom materiálu do sklovitej fázy.
Tá istá štúdia zistila, že pomalé chladenie pod oblasťou žíhania pomáha zabrániť opätovnému nárastu veľkých gradientov a pnutia.
Samostatný termomechanický výskum zistil, že žíhanie v blízkosti Tg výrazne mení zvyškové pnutie a zoslabuje jeho závislosť od predchádzajúcej rýchlosti chladenia.
Tieto štúdie podporujú základnú stratégiu riadenia procesu. Samy o sebe však neoverujú každú konkrétnu nastavenú hodnotu v celotelovom protokole Tomorrow.bio.
Celé ľudské telá sú väčšie a tepelne nerovnomernejšie než laboratórne roztoky alebo jednotlivé orgány. Preto sú naďalej nevyhnutné priame teplotné záznamy a zobrazovacie vyšetrenie po chladení.
Čo počítač zaznamenáva
Užitočným výstupom nie je iba správa s oznámením „chladenie dokončené“. Dôležitý je úplný časový záznam z každého teplotného kanála.
Záznam má ukazovať rýchlosti, prestávky, prehriatia, gradienty medzi senzormi, zásahy riadiaceho systému, alarmy a akúkoľvek odchýlku od plánovanej krivky.
Tieto údaje sa stávajú súčasťou hodnotenia kvality kryopreservácie.
Po skončení chladenia môže štandardizované CT vyšetrenie pri teplote tekutého dusíka odhaliť rozloženie kryoprotektívnej látky, prítomnosť ľadu, výrazné deformácie a trhliny, ktoré samotné teplotné údaje neodhalia.
Prečo proces končí pri teplote tekutého dusíka
Pri normálnom atmosférickom tlaku vrie dusík približne pri 77,34 kelvina, čo zodpovedá približne -195,8 °C, podľa NIST Chemistry WebBook.
Uskladnenie v tekutom dusíku nevyžaduje aktívne chladenie. Kým je v nádobe dostatočné množstvo kvapaliny, rovnovážny var udržiava stabilné kryogénne prostredie bez potreby mechanického chladenia.
Riadené chladenie sa ukončí až vtedy, keď je pacient tepelne pripravený na tento stabilný stav. Uskladnenie nikdy nenahrádza samotné riadené chladenie.
Konštrukcia nádob a kompromisy spojené s ďalšou fázou sú opísané v článku o moderných kryogénnych dewarových nádobách a uskladnení pri prechodných teplotách.
Zhrnutie: Tomorrow.bio používa počítačom riadené chladenie a vnútorné teplotné senzory. Proces telo najprv rýchlo ochladzuje až k oblasti skleného prechodu, potom umožňuje uvoľnenie tepelného pnutia a napokon teplotu pomaly znižuje smerom k -196 °C.
Preskúmajte tento praktický nástroj
Použite interaktívny nástroj na preskúmanie otázky v tomto článku.
Interaktívny nástroj sa načítava...
Ďalšie čítanie